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荧光光谱基本原理

发布日期:2019-07-01    

【关键词】:

荧光光谱基本原理

一、概念

1.荧光物质的分子吸收了照射光的能量后,处于基态最低能级的分子被激发到电子激发态的各个振动能级。被激发的分子与周围的分子碰撞,并把部分能量以热能的形式传给周围的分子,自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后,由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁,同时以发光的形式释放出其能量。这种光即为荧光。

2.激发:基态(S0)→激发态(S1S2激发态振动能级):吸收特定频率的辐射;跃迁一次到位。

3.失活:激发态 →基态:多种途径和方式;速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。

4.荧光条件:它吸收光子发生多重性不变的


5.吸收光谱:化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲线

6.激发光谱:让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光,而让荧光通过固定波长的发射单色器照射到检测器上,检测荧光强度变化。

7.发射光谱:固定激发波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位),扫描出的化合物的发射光强(荧光/磷光) 与发射光波长的关系曲线。

 

二、工作原理

(一)激发光谱和荧光光谱

任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱,即激发光谱(excitation spectrum)和荧光光谱(fluorescence spectrum)。激发光谱:将激发光的光源用单色器分光,连续改变激发光波长,固定荧光发射波长,测定不同波长的激发光照射下,物质溶液发射的荧光强度的变化。激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性和定量的基础。

以激发光波长为横坐标,荧光强度为纵坐标作图,即可得到荧光物质的激发光谱。从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长λex

荧光光谱:用最强激发波长λex作激发光源,并固定强度,而让物质发射的荧光通过单色器分光,测定不同波长的荧光强度。荧光物质的λex和λem是鉴定物质的依据,也是定量测定中所选用的最灵敏的波长。

以荧光波长为横坐标,荧光强度为纵坐标作图,便得荧光光谱。荧光强度最强时的波长称为最大发射波长λem

(二)荧光分析的特点

优点:灵敏度高(可达1012个数量级);选择性强,有利于分析复杂的多组分混合物;用样量少、特异性好、操作简便。

缺点:对温度、pH值等因素变化比较敏感;应用范围较窄,只能用来测量发荧光的物质,或与某些试剂作用后发荧光的物质。

 

三、荧光光谱仪的主要结构

激发光源:用来激发荧光物质产生荧光,可以用卤钨灯、氙灯、汞灯、氙-汞弧灯、激光器以及闪光灯等,最常用的是氙灯。

单色器:分离出所需要的单色光。荧光光谱仪有两个单色器,一是激发单色器,用于将入射的激发光变成单色光;二是发射单色器,用于将发射的荧光变成单色光。

样品池:放置测试样品,用石英做成。

检测器:接受光信号并将其转变为电信号。

记录显示系统:检测器出来的电信号经过放大器放大后,由记录仪记录下来,并可数字显示。

 

四、荧光光谱仪的性能指标:

荧光光谱仪的性能指标主要包括:灵敏度、波长范围、波长精度、分辨率、光谱带宽、信噪比。

1.灵敏度

灵敏度是指能被仪器检出的最低信号,或某一标准荧光物质稀溶液在选定波长的激发光照射下能检出的最低浓度,是仪器最重要的性能指标之一。

多数荧光光谱仪的灵敏度较高,可达10-10g~10-12g水平,有利于检测体液中的微量物质。

2.波长范围

波长范围指荧光光谱仪的有效工作波段,包括激发通道波长范围、投射通道波长范围和荧光通道波长范围。波长范围越大,应用范围越广。

一般荧光分光光度计都采用氙灯作光源,光栅为单色器分光元件,其有效工作波段在200nm1000nm范围之内。

3.波长精度

指其波长计数器的指示值与真实光波长的数值相符的程度。

特定的激发波长和发射波长是定性分析和定量测定的基础,因此波长精度也是荧光光谱仪的核心指标之一。目前荧光分光光度计的波长精度误差在±(0.2nm2nm)范围之内。

4.分辨率

指荧光仪器对靠近的峰尖分开的能力,它与波长精度有密切关系,决定着对混合物成分分析特异性的好坏。常用仪器的分辨率在0.2nm5nm之间,主要由光栅的每毫米刻线数决定。

5.光谱带宽

指仪器主机狭缝宽窄程度的指数。

以一定狭缝几何密度对应的光谱半宽度来直接表示光谱纯度。光谱纯度直接影响仪器的分辨率、灵敏度以及背景干扰。目前的荧光分光光度计的光谱带宽在0.15nm20nm之间,一般都采用连续可调方式。

6.信噪比与响应速度

用空白样品测得的峰值叫做噪声峰值,待测样品测得的峰值和噪声峰值之比就叫做信噪比。信噪比越高,检测结果的准确性也越高。

仪器的响应速度是指电路样品通道对光电信号反映的快慢。响应速度关系到波长扫描速度的选择、光谱峰的尖锐程度以及随机噪声的大小。

 

五、荧光光谱仪应用

荧光光谱仪被广泛应用于化学、环境和生物化学领域。是研究小分子与核酸相互作用的主要手段。通过药物与核酸相互作用,使DNA与探针键合的程度减小,反映在探针荧光光谱的改变,从而可以了解药物和核酸的作用机理。

荧光光谱仪是研究药物与蛋白质相互作用的常用仪器。药物与蛋白质相互作用后可能引起药物自身荧光光谱和蛋白质自身荧光(内源荧光)光谱以及同步荧光光谱的变化,如荧光强度和偏振度的改变、新荧光峰的出现等,这些均可以提供药物与蛋白质结合的信息。

 

 

 

 

 

 


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